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怎樣合理優(yōu)化「胚胎干細胞」培養(yǎng)流程,細胞培養(yǎng)更便捷?

更新時間:2022-11-25  |  點擊率:683

什么是胚胎干細胞?

胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES cell)也稱ES細胞,是一種存在于著床前早期胚胎中的具有全能性的細胞。

胚胎干細胞能在體外進行培養(yǎng)傳代,保持未分化二倍體狀態(tài)以及其全能性,具有形成嵌合體動物(chimeric animal)的能力。

由于其具有全能性,故廣泛用于胚胎發(fā)育及胚胎工程方面的研究。

胚胎干細胞體外培養(yǎng)的原則是:

在促進胚胎干細胞增殖的同時,維持其未分化二倍體狀態(tài)。胚胎干細胞一旦分化即失去其全能性,失去二倍體正常核型的細胞則會大大降低形成嵌合體(chimera)的能力,特別是進入種系形成生殖細胞的能力。

胚胎干細胞體外培養(yǎng)的一般方法:

目前體外培養(yǎng)胚胎干細胞的方法歸納起來有二大類:有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法。

(一)有飼養(yǎng)層培養(yǎng)法:

主要應用小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)和STO細胞作為飼養(yǎng)細胞(MEF 和STO都能分泌促進胚胎干細胞增殖和抑制胚胎干細胞自主分化的因子);經(jīng)si裂霉素-C或γ-射線處理終止其分裂后制備成飼養(yǎng)單層(feeder layer),將胚胎干細胞種植在這樣的單層上。

實驗過程,主要分為以下三步:準備飼養(yǎng)層細胞、飼養(yǎng)單層制備、接種干細胞培養(yǎng)。

飼養(yǎng)層培養(yǎng)法卻存在著不可避免的缺點:

1、 飼養(yǎng)層細胞生命期有限,不能在體外長期傳代。在體外傳代時間太長,其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會減弱甚至喪失。

2、 MEF細胞的染色體干擾:飼養(yǎng)層細胞會影響干細胞遺傳物質(zhì)?!?/p>

3、 si裂霉素-C的影響:飼養(yǎng)層細胞需要用到si裂霉素-C,該物質(zhì)可能會影響干細胞的增殖。

4、 異種抗原及污染的影響:飼養(yǎng)層細胞作為異種抗原也會影響干細胞的健康,還有發(fā)生細胞間融、引入其他動物源性病原體,給臨床移植治療帶來風險。

5、 所用試劑復雜,批次不可控:所用材料的批次之間的波動,限制了培養(yǎng)物之間的可重復性。

6、 實驗周期長,培養(yǎng)基配制復雜:現(xiàn)在市場上有多種多樣的干細胞培養(yǎng)基可供選擇,大多數(shù)都是在基礎培養(yǎng)基的基礎上,添加例如白血病抑制因子(LIF)這樣的多功能細胞因子,但無論進口還是國產(chǎn)的產(chǎn)品,都不免有價格高昂的缺點。而自己配制,又會面臨操作繁瑣、易污染等問題。而且飼養(yǎng)層培養(yǎng)法從培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞開始,至少需要一周時間才能得到所需的干細胞,周期過長。

(二)無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法:

利用各種能分泌抑制分化因子的細胞制備條件培養(yǎng)基,或在基礎培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備成條件培養(yǎng)基。使用這樣的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞,可以不使用飼養(yǎng)層細胞,能保證小鼠胚胎干細胞增殖的同時維持未分化二倍體狀態(tài)。

無飼養(yǎng)層培養(yǎng)類似普通細胞培養(yǎng),主要分為以下幾個步驟:培養(yǎng)瓶預處理、配制培養(yǎng)基、消化干細胞、接種、培養(yǎng)。

相較于飼養(yǎng)層培養(yǎng)法,無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法的優(yōu)點顯而易見:更加簡便、節(jié)省時間;但缺點也十分明顯:

1、 培養(yǎng)的細胞質(zhì)量不穩(wěn)定:由于自行配制的培養(yǎng)基,不可控因素較多,缺少營養(yǎng)細胞對的存在,干細胞生長狀況也不穩(wěn)定,直接影響實驗結果。

2、 成本高昂:商品化的培養(yǎng)基,根據(jù)品質(zhì)不同,價格也是從幾百元到幾千元不等,直接增加了干細胞的培養(yǎng)成本。

3、 需要不斷對培養(yǎng)基進行調(diào)整,對實驗人員有很高的要求:無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法需要人為添加各種各樣的細胞因子,不同的干細胞還需要進行細微的調(diào)整以適應不同的生長需求,因此培養(yǎng)難度更高,對技術人員的操作水平及經(jīng)驗有很高的要求。

更便捷的干細胞培養(yǎng)

近日,一項新技術——干細胞完quan培養(yǎng)基培養(yǎng)法問世!這項重大突破,兼顧了上述兩種培養(yǎng)法的優(yōu)點又巧妙規(guī)避了它們的致命缺點,大大降低了干細胞培養(yǎng)的技術門檻!

Ausbian干細胞完quan培養(yǎng)基,在含微量胎牛血清的基礎培養(yǎng)基中,通過添加一種人永生化干細胞系的條件培養(yǎng)基混合組成,含有多種生長因子,具有促進干細胞增殖、抑制干細胞分化及維持干細胞表型,增加干細胞的傳代次數(shù)的作用,可廣泛應用于人及動物的胚胎干細胞、間充質(zhì)干細胞及各種組織來源的成體干細胞的培養(yǎng)。

無需額外添加和二次配制,更省去了體現(xiàn)制備飼養(yǎng)層的復雜操作,根據(jù)細胞生長情況每2-3天更換一次培養(yǎng)基,使實驗更簡單,可以大大縮短時間成本;培養(yǎng)的干細胞品質(zhì)更穩(wěn)定,對實驗人員技術要求也更低,節(jié)省人力成本,輕輕松松讓干細胞茁壯成長。


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